摘要：文章用自制的明胶肽灌胃饲养SD 大鼠实施营养干预，通过电刺激方法诱发动物疲劳，在评价明胶肽抗疲劳功效的基础上，检测疲劳动物前肢腓肠肌肌肉中的ATP含量、ATP酶活性和肌电积分。实验结果显示：和蒸馏水饲养组对比，明胶肽能延长动物运动时间，降低疲劳后的血乳酸和尿素氮含量，提高肝肌糖原含量，具有显著的抗疲劳功效；ATP 酶活性实验组为3.92，对照组为2.33，ATP 含量实验组为31.71，对照组11.58；肌电积分实验组明显比对照组多（2.39＞1.32）；分析以上数据，明胶肽抗肌肉疲劳的可能通路是在增加糖原含量的基础上，作为信使改善ATP酶活性，提高ATP生成量，增强了肌肉的做功能力，达到抗疲劳功效。

关键词：明胶抗疲劳肽ATP酶肌电积分信号转导通路

抗疲劳肽因其安全高效成为近年来功能食品研究的热点，但是，相关研究主要依据保健食品的功能学评价程序和检验方法中的判定标准评价活性成分的营养功效，对于作用机制和信号转导通路缺乏深入分析，从而使相关产品的市场推广难以扩展，形成开发热而消费不旺的尴尬局面。本研究通过灌胃饲养明胶肽实施营养干预在评价营养功效的基础上，检测了疲劳动物ATP 酶活性、含量和肌电积分，分析信号转导通路，希望明确作用机制，为活性肽抗疲劳机制的研究和市场应用提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

SD 封闭群无菌型大白鼠40 只，180～200g；购自西安交通大学动物试验中心。

1.1.2 试验食品与试剂

食品级明胶（山东淄博宝恩生物科技有限公司提供）；胰蛋白酶（Wolsen）；明胶肽（自制，用胰蛋白酶水解明胶，酶解工艺条件：pH7.2，酶含量为4%，原料的质量浓度为4%，水解温度为44℃，时间5h，酶解液15%TCA 除蛋白，超滤膜分离、收集不同分子量组分）；血乳酸试剂盒、尿素氮试剂盒、肝（肌）糖原试剂盒、ATP 含量测定试剂盒、超微量ATP 酶测试盒（南京建成生物技术研究所）；其余试剂为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

解剖动物手术器械一套、解剖台等；GY-640 四道生物信号采集系统（开封生物仪器厂）；JL-C4 电刺激器（上海嘉龙仪器厂）；JH-21 型肌肉张力换能器器（量程300g，北京新航天医学公司生产）；PHS-3C 型台式PH 机（上海精密科学仪器有限公司）；HHS 型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）；TCL-16G 型台式离心机（江苏省金坛医用仪器公司）；JA5103N 型电子天平；FSH-2 型高速匀质器；722N 型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；其余为常规仪器。

l.2 方法

1.2.1 大白鼠分组饲养

按照体重进行随机分组，共分成4 个组，一个对照组和三个试验组。日常自由采食饮水，灌胃饲养28 天，对照组灌胃双重蒸水，试验组分别给予不同分子量分布的明胶肽组分（质量浓度为2%，三个实验组明胶分子量分布分别为1#＜3KDa、3KDa≤2#＜5KDa、5KDa≤3#＜10KDa），饲养量为动物体重的3%。

1.2.2 最适电刺激强度的测试

将一对间距2.5mm 的刺激银丝电极搭在腓肠肌肌腹正中隆起处，与肌纤维走向平行，电极间距0.3cm，电极阻抗是2kΩ；安放电极前用医用酒精将安放电极处皮肤进行反复清洗去除表面脂肪，减少电阻误差。贴电极时，电极下涂适量导电膏，电极用薄橡胶条包裹固定，电极的另一端与HL-2000 实验系统的输出端连接。电极使用的刺激从0v 开始，刺激强度范围：0-20v；5-20Hz。随刺激强度的增加肌肉开始收缩，其幅度逐渐增大，当刺激强度达某一个数值时，再增大刺激强度，收缩幅度不再增大。确定引起最大收缩幅度为最适刺激强度。

1.2.3 疲劳动物肌电积分的采集、分析和计算

末次灌胃2h 后开始实验，使用HL-2000（4 道）生物信号采集系统连续采集sEMG 信号。信号采样频率为1000Hz，输入阻抗小于50MΩ，噪声水平小于1μｖ，A/D 转换12bit，差分放大器的放大倍数为100 倍，CMMR>100dBt。时域特征反映表面肌电信号振幅变化的指标是iEMG。频域特征反映表面肌电信号功率谱变化的指标为MPF 和MF。动物分为4 组，用幅度2.0mA（超强刺激）、波宽200uv、频率是20Hz 的刺激信号不间断施于

大白鼠的坐骨神经，使同侧的腓肠肌做等长收缩运动。肌肉出现强直收缩时判定为疲劳，停止刺激，用HL-2000 生物信号采集系统自带软件分析表面肌电的平均功率频率（MPF）、中位频率（MF）和积分肌电（iEMG）。数据采用Spss11. 5 统计软件包进行统计分析，各组别间MPF、MF 以及iEMG 差异检验分别采用t检验。P<0.05 为具有显著性差异，P<0.01 为具有非常显著性差异。

1.2.4 样品采集、处理和检测

运动肌肉组织匀浆的制备：将疲劳大鼠放在粗糙的平面上，左手向下按压颈椎，右手拉住大鼠尾部向后上方拉使颈椎脱臼处死大鼠（考虑化学麻醉导致组织留存较多血液，同时检测指标受化学试剂干扰影响测试结果，避免化学麻醉处死），在冰面上解剖后剥离取前肢，经冰冻生理盐水漂洗后用滤纸吸干，加5%TCA 沉淀蛋白，取适量湿组织加生理盐水按W：V=1：10 在冰浴条件下用组织匀浆机制成匀浆，组织匀浆时选择小刀，肌肉组织控制转速为6000 r/min，时间为15min。随后于8000r/min 离心8min ，取上清液，按照卫生部卫生监督司l996 年颁布的“保健食品的功能学评价程序和检验方法”检测血乳酸、尿素氮、肝（肌）糖原含量[1]。按照试剂盒指定的方法测定ATP 酶活性和含量。