摘要：实验以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为发酵菌株、菜籽粕为原料，菜籽多肽得率和硫代葡萄糖苷（硫苷）降解率为发酵菜籽粕品质的主要评价指标，通过单因素实验及Box-Behnken响应面分析法对固态发酵制备菜籽多肽的工艺进行研究，得到最佳发酵工艺条件为：发酵时间为70h，液料比为1.3∶1mL/g，接种量为15%，发酵温度为31℃，此时多肽得率、硫苷降解率可达15.94%、62.14%，两者的综合评分达到最高值，与响应面理论值吻合性良好。

关键词：枯草芽孢杆菌，固态发酵，多肽，响应面分析

油菜籽是中国最主要的油料资源之一，近年来其产量在世界上名列前茅[1]。油菜籽榨油之后得到的副产物为菜籽粕，后者富含蛋白质、矿质元素和维生素，氨基酸组成较平衡，是一种营养价值很高的植物蛋白资源[2]。但菜籽粕含有硫苷、芥酸、单宁和植酸等抗营养因子，严重限制了它的应用范围[3-5]。菜籽肽是以菜籽粕或菜籽蛋白为原料通过降解而得到的一种低分子肽混合物，不但具有一定的营养功能，还具有多种生物活性，如抗氧化，降血压等。目前，以菜籽粕或菜籽蛋白为原料制备菜籽肽的方法主要有酶水解法、微生物发酵法和化学水解法。微生物发酵法可以利用微生物产生的丰富的酶系，将菜籽粕中的大分子蛋白水解成菜籽肽的同时降解菜籽粕中的有毒物质和抗营养因子[6-10]，因而备受关注。固态发酵与其他培养方式相比具有培养基简单且来源广、技术较简单、投资少、能源消耗低、后期处理较简单、发酵过程粗放等优点[11-13]。本实验采用微生物固态发酵法同时生产菜籽肽并降解硫苷，采用响应面分析的方法及多指标实验设计综合加权评分法优化菜籽粕固态发酵工艺，兼顾抗营养因子的脱除和多肽的得率，以获得最优的发酵工艺条件，降低生产成本，缩短发酵周期，提高菜籽粕品质及综合利用率，为菜籽粕的有效开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菜籽粕w（粗蛋白）≥40.80%，w（水分）≤9.0%，硫苷≥46.51μmol/g，40目过筛，由丹阳市正大油脂有限公司提供；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）W1-3 本实验室从镇江恒顺醋醅分离得到，北京诺赛基因公司鉴定；Gly-Gly-Tyr-Arg 购于SIGMA公司；其他试剂分析纯；基础种子培养基含蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、牛肉浸膏0.3%、琼脂2%，pH7.0；种子培养基含蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、牛肉浸膏0.3%，pH为7.0；固态发酵培养基菜籽粕30g，水依据发酵实验不同的设计要求加入。BS124S型电子天平赛多利斯科学仪器有限公司；YX280A型灭菌锅上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司；PHS-25型数显pH计上海精密科学仪器有限公司；UV-1601型紫外可见分光光度计北京诺利分析仪器公司；LRH-250型生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司；TGL-16型高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；QYC-200型全温空气摇床上海福玛实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基础种子与种子液制备将实验室保存的菌种接种基础培养基上，在30℃的生化培养箱中静止培养24h，让菌种活化。挑取活化后的2环菌体接入100mL灭过菌的装有种子培养基的锥形瓶中，8层纱布封口，放在空气摇床中进行扩大培养，温度为30℃，转速180r/min，培养24h。从上述培养好的菌液中按5%的接种量接种到50mL发酵种子培养基中，培养12h，制成发酵种子液。

1.2.2 固态发酵培养吸取一定体积上述种子液，接种于装有灭好菌的固态发酵培养基的250mL锥形瓶中，用无菌玻璃棒搅拌混匀，锥形瓶用8层纱布封口，一定温度下恒温发酵一定时间后，将样品放入干燥箱中，50℃烘干后，粉碎过40目筛。

1.2.3 菜籽多肽得率的测定参照文献[14]。取5g粉碎后的固态发酵基质加入蒸馏水，定容到100mL，搅拌30min，5000r/min离心30min。取上述上清液2mL，加入10%的三氯乙酸水溶液2mL，混匀后静置10min，再12000r/min离心15min。取2mL上述溶液于玻璃试管中，加入8mL 双缩脲试剂，混匀后静置10min，4000r/min离心10min，于540nm下测定上清液OD值，对照标准曲线求得样品多肽浓度，多肽得率按照以

下公式计算：多肽得率（%）= C×VM ×100式中：C为发酵液中多肽浓度，mg/mL；V为发酵液总体积，mL；M为菜籽粕质量，mg。

1.2.4 硫苷含量的测定参照文献[15]。硫苷降解率

按照以下公式计算：硫苷降解率（%）=（原菜籽粕中硫苷含量-发酵菜籽粕中硫苷含量）/原菜籽粕中硫苷含量×100

1.3 实验设计

1.3.1 单因素实验设计其他因素条件固定，依次分别以发酵时间（36、48、60、72、84、96h），液料比（0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.4∶1、1.6∶1mL/g）、接种量（5%、10%、15%、20%、25%）和发酵温度（25、30、35、40℃）为单因素，考察各因素对多肽得率和硫苷降解率的影响，确定其最佳因素水平。选取前一个单因素的最优水平进行后一个单因素实验的研究，研究第一个单因素（发酵时间）时其他因素水平固定为：发酵温度30℃、接种量10%、液料比1∶1。

1.3.2 响应面实验设计根据单因素实验，选取对

发酵影响较大的发酵时间（A）、液料比（B）和发酵温度（C）三个单因素为研究因素，以多肽得率（Y1）、硫苷降解率（Y2）和两者的综合评分（OD）为评价指标，进行响应面优化实验的中心组合设计。因素及其水平如表1所示，-1、0、1分别代表各因素的低、中、高3

个水平。

1.4 数据处理与分析

1.4.1 数据进行方差分析的软件为SPSS 16.0；响应

面设计与分析的软件为Design-Expert 8.0；实验数据均为3次平行实验的平均值。

1.4.2 综合评分（overall desirability，OD） 在实际生产过程中，既需最大限度地对菜籽粕中的抗营养物质进行降解，又要保证较高的多肽的得率，所以选取多肽得率和硫苷降解率一同作为评价指标进行综合评分，并且将两者权重系数均设为0.5，则：OD＝（D1×0.5＋D2×0.5）。在计算综合指标之前，采用极差化法将各指标进行规格化[16]。由于多肽得率和硫苷降解率均要求达到最大化，其规格化方程为：Di=（Yi-Ymin）/

（Ymax-Ymin），其中，Ymax和Ymin分别为各指标的最大值与最小值，若某实验的指标值为Ymax时，将Di设为1。反之，某个指标值为Ymin时，Di为0[17]。