摘要: 应用高效液相色谱原理建立核桃青皮中胡桃醌活性成分的分析测定方法，该方法的线性回归方程为y =598 860x － 49 983 ( r2 = 0． 999 1) ，线性范围为10 ～ 150 μg /mL，该方法的精密度、稳定性、重复性良好，回收率为93． 90% ～ 95． 14%，相对标准偏差小于2%。关键词: 高效液相色谱; 胡桃醌; 核桃; 青皮胡桃醌是核桃青皮中的有效成分，具有抗肿瘤、抑菌及抗病毒、抗氧化等活性，目前已被应用于医药方面的研究［1］。高效液相色谱的分离原理与其他色谱法相同，都是利用混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同而被分别分离的原理［2］。现在使用的微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度非常高，不仅能控制仪器的相关操作参数( 如溶剂的梯度洗脱、流动相流量与流速、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等) ，而且还能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，并对保留时间和峰高、峰面积进行综合处理，使色谱分析工作者能高效率、高质量、高标准地完成分析工作［3］，因此它在天然产物中活性物质的研究及植物药的发展中起着非常重要的作用。天然产物中活性物质不像化学药品那样简单、规范、物质单一，它们不仅有着非常复杂的成分，而且各种成分之间可能会相互影响和相互作用。因此，根据不同的分析对象、目的以及要求，可以利用高效液相色谱技术对天然产物某一成分化合物建立高效、灵敏、准确的分析方法或定量方法。本试验就是利用高效液相色谱技术，建立了一种对胡桃醌含量的高效、快速的HPLC 检测方法。1 材料与方法1． 1 材料核桃主要由贵州省赫章县提供。97%胡桃醌标准品( Sigma 公司) 、磷酸、磷酸氢二钠、无水乙醇、氯仿、氢氧化钠均为分析纯，甲醇为色谱纯。Agilent1100 高效液相色谱仪，PHS － 3C 型精密pH 计( 上海精密科学仪器有限公司) ，XS － 20B 粉碎机( 上海兆申电子科技有限公司) ，ALC － 110． 4 电子天平( 北京赛多利科学仪器有限公司) ，ＲE － 52A 旋转蒸发仪( 上海亚荣生化仪器厂) ，H － 1850Ｒ 型高速冷冻离心机( 长沙湘仪离心机仪器有限公司) ，101 － 2AB 型电热鼓风干燥箱( 天津泰斯特仪器有限公司) ，SC － 316 冰箱( 山东省青岛海尔股份有限公司) ，78 － 1型磁力搅拌器( 江苏省常州澳华仪器有限公司) ，KQ － 50 型超声波清洗器( 江苏省昆山市超声波仪器有限公司) 。1． 2 方法1． 2． 1 色谱条件色谱柱选用C18柱( 4． 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流动相采用甲醇－ 水( 体积比1 ∶ 1) ，水相先用磷酸调节pH 值约为4，流速为0． 8 mL/min，紫外检测波长为250 nm，柱温为30 ℃。1． 2． 2 胡桃醌标准溶液的制备精确称取胡桃醌标准品5． 0 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解( 在超声波清洗器上振荡5 min 后) 在室温下冷却后再用甲醇定容，摇匀，即得200 μg /mL 胡桃醌标准溶液。标准溶液须放在冰箱中保存，防止甲醇挥发和长时间放置在阳光下使标准溶液物质分解，给试验带来误差。1． 2． 3 最大吸收波长的测定和选择对胡桃醌标准溶液在220 ～ 400 nm 的范围内进行紫外光谱扫描，选定检测波长。1． 2． 4 流动相组成的确定以甲醇－ 水体系作为流动相，进行等度洗脱。固定流动相的流速为0． 8 mL/min。为了选择最佳的流动相配比，改变流动相中甲醇的比例，使其体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，测定胡桃醌标准溶液的保留时间和峰面积。1． 2． 5 pH 值的确定常用来调节流动相pH 值的化合物有磷酸、醋酸、磷酸盐缓冲溶液和醋酸盐缓冲溶液。本试验采用磷酸来调节pH 值而不采用醋酸的主要原因是磷酸的紫外吸收较小且属于中等强酸，等量的0． 1%磷酸溶液和1%醋酸溶液的pH 值相等，除此之外，磷酸还不损坏色谱仪器的接口。用磷酸调节水相的pH 值分别为2、3、4、5、6、7，加入流动相中的有机相和水相的体积比为1 ∶ 1，测定不同pH 值下胡桃醌标准溶液的保留时间和峰面积。1． 2． 6 柱温的选择本试验考察了温度对色谱分离的影响，在选定的上述条件下，分别在柱温为18、22、26、30、34、38、42 ℃ 时测定胡桃醌标准溶液的保留时间和峰面积。1． 2． 7 标准曲线的建立用甲醇稀释200 μg /mL 胡桃醌标准溶液，制备质量浓度为10、20、50、100、120、150 μg /mL 系列标准品工作溶液，按照上述确定的色谱条件测定标准品系列工作溶液的峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作工作曲线，求得标准曲线方程。1． 2． 8 精密度试验取质量浓度分别10、50、100 μg /mL 标准溶液，按照已经确定的色谱条件，各进样3 次，分别测定峰面积并计算胡桃醌浓度、相对标准偏差( ＲSD) 。1． 2． 9 稳定性试验将20 μg /mL 标准溶液放置在室温条件下，不做任何避光保护，每隔2 h 进样测定1 次，共进行5次，分别测定其峰面积并计算胡桃醌浓度、相对标准偏差。1． 2． 10 重复性试验取20 μg /mL 标准溶液5 份，按上述色谱条件连续进样，分别测定峰面积并计算胡桃醌浓度、相对标准偏差。1． 2． 11 加标回收率试验分别取3 份5 mL 50 μg /mL 的标准溶液，分别加入0． 5、0． 8、1． 0 mL 200 μg /mL 胡桃醌标准溶液，按照上述进样方法操作，测定其峰面积，重复测定3 次，计算平均回收率、相对标准偏差。