SSRs(Simple Sequence Repeat)即简单序列重复, 亦称微卫星DNA (Microsatellite DNA)是近年来发展起来的建立在PCR(Polymerase Chain Reaction)基础之上的新型遗传标记。研究发现, SSRs 极丰富地分布在植物基因组中, 并具有很高的多态性, 如水稻、大豆、玉米、油菜、小麦、大麦等。现在SSR 标记已被广泛用于基因定位, 种群进化及遗传多样性研究。研究表明SSR 位点的等位基因数目比其他类型标记揭示的等位基因数目多, 同时因其使用程序简单、快速、重复性好, 被认为是一种理想的遗传标记。在研究中发现, SS R 位点的等位基因数目除与供试材料数目、种类以及所用引物有关外, 与凝胶电泳检测系统的关系也很密切。本文以14 个玉米自交系为材料比较3 %Metaphor 琼脂糖凝胶和12 %聚丙烯酰胺凝胶对35 个SSR 引物扩增产物多态性水平的影响, 探讨不同凝胶检测系统在玉米遗传变异研究中的应用。

1 　材料和方法

1.1 　试验材料

供试的14 个玉米自交系及其来源见表1 , 其中多数自交系为我国玉米生产上推广杂交种的亲本。

1.2 　SSR 引物

试验所使用的35 个引物取自bngl/phi 引物盒(Research Genetics ,Hunt sville)。

1.3 　DNA 提取

采用Sag hai-Maroof 等提出的C TAB 法提取DNA 。用Beckman DU-65型分光光度计检测DNA 浓度和质量, 把DNA 浓度统一调至10 ng/μL , 备用。

1.4 　扩增反应

PCR 扩增反应在PTC-225 PCR 仪(MJ Research , Watertown , MA)上进行。每20 μL 反应体积中含有10 mmol/LT ris-HCl , 50 mmol/L KCl , 0.001 %Gelatin ,1 单位TaqDNA 聚合酶, 2.5 mmol/LMgCl2 , 0.16 mmol/L -4dN TP , 10 %甘油, 0.6 μmol/L SSR 引物对, 50 ng DNA模板。反应液上加盖28 μL 矿物油(SigSigma),以防止反应过程中水分蒸发。

热循环反应过程包括:93 ℃模板DNA 预变性1 min , 1 个循环;93 ℃模板DNA 变性1min , 60 ℃引物与模板靶位点结合2 min , 70 ℃引物沿模板延伸2 min , 共30 个循环;最后在72 ℃延伸5 min 。

1.5 　Metaphor (3 %)凝胶电泳检测

在扩增产物中加入5 μL 溴酚蓝指示剂, 上样20 μL , 在3 %浓度的Metaphor 琼脂糖(FMC Rockland ,ME)凝胶上分离。以ΥΦ174/Hae Ⅲ片段为分子量标准, 在100 V 恒压下电泳3 h , 用溴化乙锭(0.15 μg/mL)染色。在紫外检测仪下观察电泳结果, 用保利来(Polarid)665 型相纸一次成像。

1.6 　聚丙烯酰胺凝胶(12 %)电泳检测

采用JIRCAS ATTA 型电泳装置(日本制造, 规格16cm ×20 cm ×0.1 cm), 双面电泳。配制12 %聚丙烯酰胺凝胶40 mL :12 mL 40 % Polyacrylamide (acrylamide∶bisacrylamide =19∶1), 4 mL 1 ×TBE , 24 mL ddH2O , 20 μL TEMED , 160 μL25 %APS (Ammonium persulfate25 %w/v)。在加入TEMED 和APS 后, 立即倒胶, 约30 min 后, 胶凝固。固定玻璃板,倒入1 000 mL 1 ×TBE 缓冲液(内、外槽各500 mL)。在250 V 电压下, 电泳2 h 。然后凝胶依次在10 %冰乙酸中浸泡30 min , 水洗3 次(每次10 min), 0.1 %AgNO3(加入100 μL 38 %Formaldehye)中浸泡30 min , 快速用水冲洗2 次, 然后在2.5 %Na2CO3 (加入50 μL 2.5 %Na2S2O3 , 50 μL 38 %Formaldehye)中显影至带型可以区分为止。用10 %冰乙酸终止显影。在白炽灯下观察电泳结果, 用保利来(Polarid)665 型相纸一次成像。

1.7 　数据统计分析

SSR 扩增产物以0 , 1 , 9 统计建立数据库。在相同迁移率位置上, 有带记为1 , 无带记为0 , 缺失数据记为9 。以简单配对参数(Simple matching coef ficient)估计基因频率, 采用N TS YS-pc version-1.8 (Rohlf 1992)统计软件, 依据GS =m/(m +n)计算供试自交系之间的遗传相似系数, 其中m 为基因型间共有带数目, n 为差异带数目每一个SSR 位点的多态性信息量(Polymorphic Information Co ntent 简称PIC)按Senio r MS 等提供的公式计算, 即PIC =1 -Σf2i, 其中f i 为i 位点的基因频率。

2 　结果与分析

2.1 　两种凝胶电泳系统检测结果的比较

采用来自bng l/phi 引物盒的45 个SSR 引物对14 个玉米自交系进行同源位点扩增, 其中有30 个引物(见表2)的扩增产物在3 % Metaphor 凝胶上具有多态性, 带型稳定;5 个引物扩增产物带型呈单态性;10 个引物不能有效地启动基因组DNA 或扩增质量差。选用在3 %Metaphor 凝胶上带型稳定的35 个引物, 其扩增产物在12 %聚丙烯酰胺凝胶上重新检测, 结果35 个引物的扩增产物带型都呈多态性。

能有效地扩增14 个玉米自交系DNA 的35 个引物分布于玉米10 条染色体上。用3 %Metaphor 凝胶检测时, 共揭示出86 个等位基因, 每个位点1 ～ 4 个, 平均为2.46 个;平均多态性信息量(PIC)为0.419 , 变化范围为0 ～ 0.745 。在12 %聚丙烯酰胺凝胶上, 共检测出108 个等位基因, 每个位点2 ～ 5 个, 平均为3.09 个;平均多态性信息量(PIC)为0.492 , 变化幅度为0.132 ～ 0.781 。比较分析表明, 在12 %聚丙烯酰胺上检测到的等位基因数和多态性信息量都显著多于在3 %Metaphor 琼脂糖凝胶上检测的结果。这说明聚丙烯酰胺凝胶区分差异微小片段的能力显著高于3 %Metaphor 琼脂糖凝胶。

从表2 可以看出两种凝胶电泳系统下, 前10 位具有较大PIC 值的SS R 引物所揭示的遗传多态性信息量分别占总变异的44.4 %和41.7 %, 扩增的等位基因数占总等位基因数的40.7 %和40.8 %。这说明不同的SSR 引物在14 个自交系之间揭示的基因变异存在明显差异。在10 个引物中bngl161 , bngl162 , phi001 , bngl125 , phi126 , bngl155 , phi083 及phi053 八个引物在两种凝胶系统下均检测出高等位基因数和PIC 值。

2.2 　遗传变异比较分析

分别利用86 和108 个多态性SSR 标记计算14 个玉米自交系之间的遗传相似系数(GS)(表3)。在3 %Metaphor 凝胶电泳下, 玉米自交系之间GS 范围为0.537 ～ 0.842 , 平均为0.654 。K12 和中自451 的GS (0.537)最小, 而CA156 和掖478 之间的GS (0.842)最大。在12 %聚丙烯酰胺凝胶上检测得到玉米自交系之间GS 范围为0.456 ～ 0.814 , 平均为0.602 。K12 和中自451 的GS (0.456)依然最小, 表明两系间遗传差异较大;8112 和B73 之间具有最大GS (0.814);CA156 和掖478 的GS(0.740)仅次于8112 和B73 , 居第2 位。两种电泳系统下, 14 个玉米自交系之间GS 矩阵的相关系数为0.561 , 达到了极显著水平(P <0.01)。这表明两种凝胶电泳检测系统在分析14 个玉米自交系遗传变异方面可以获得相似信息;但比较而言采用12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 所获得遗传多态性信息会更丰富。

从表3 可以看出, 农大178 , 中自451 和K12 与其他供试自交系之间具有较大的遗传距离, 而自330 , 丹340 , 掖478 ,CA156 和K22 与其他材料之间的平均遗传距离较小, 这在两种凝胶系统下基本一致。此外, 在两种检测系统下, 均检测出自330 和丹340 具有较大的遗传相似性, 这种现象似乎与育种实践不符, 值得进一步研究。

3 　讨论

本研究利用35 个SSR 引物和14 个玉米自交系比较分析了3 %Metaphor 凝胶和12 %聚丙烯酰胺两种电泳系统对SSR 位点遗传多态性的影响。从研究结果看, 3 %Metapho r 琼脂糖凝胶在区分差异微小片段能力上不如12 %聚丙烯酰胺凝胶, 但其操作方便, 快速, 带型容易区分, 不需要复杂的电泳装置, 使用成本较低, 因此笔者认为, 在遗传作图或基因定位研究中, 可以选用3 %Metapho r 凝胶作为检测手段, 因为SSR 标记为共显性标记, 只要在两亲本间筛选出稳定的多态性带, 就可以在群体中得到体现, 然后通过连锁遗传分析, 可以将其确定在染色体上。但在品种指纹图谱分析或遗传多样性研究中建议采用12 %聚丙烯酰胺电泳作为检测手段, 在这类研究中一般需要尽可能区分出各种差异片段, 这样在品种遗传变异分析中才能得到准确结果。