木霉(T richoderma spp. )作为一种重要的植病生防因子一直受到普遍关注。研究表明, 重寄生(mycoparas itism ) 是木霉主要作用机制之一。在重寄生过程中, 木霉产生的几丁质酶可以破坏含有几丁质骨架成分的病原真菌细胞壁, 从而达到防治植物病害的效果。因此, 系统地研究木霉几丁质酶系对于了解木霉的生防机制具有重要的意义。

Harm an 等利用变性凝胶电泳首先从T.harzianum 粗酶液中检测到几丁质酶。由于此法操作简便, 分辨率高, 逐渐成为几丁质酶检测的常用方法, 许多文献报道利用此法检测几丁质酶。但最近有资料显示, 一些几丁质酶在变性电泳后不能复性, 从而显示不出活性电泳条带。绿色木霉LTR-2是我所筛选出的一株在国家农药部登记的植病生防菌( 登记证号为LS97348), 该菌株能够产生大量的几丁质酶, 对蔬菜灰霉病和棉花立枯病等植物病害有明显的防治效果。实验目的是研究木霉LTR-2的几丁质酶同工酶系,建立一种快速检测几丁质酶同工酶的灵敏方法, 为深入了解木霉的作用机理, 克隆高效几丁质酶编码基因,进而构建基因工程菌提供有力工具。

1 材料与方法

1. 1 菌种及其培养基

绿色木霉(T richoderma viride ) LTR-2由本实验室保存。PDA培养基: 马铃薯200g, 葡萄糖20g, 琼脂17~20g, 加水至1000m l。液体发酵培养基 : KNO3 10g, KH2PO4 5g, M gSO4.7H2O 2. 5g, FeCl3 2mg, 聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 10g, 蔗糖5g, 胶体几丁质5g, 加水至1000m ,l pH = 6. 0。胶体几丁质的制备 : 称取20g粉状几丁质溶于800m l预冷的浓盐酸中, 静置4h, 然后倒入2L 预冷的50%的乙醇中过夜。后用蒸馏水冲洗至中性, 并用水定容到1000m l备用。

1. 2 粗酶液的制备

将绿色木霉LTR-2接种在PDA 固体培养基上,28度 培养6d后, 用无菌水洗下孢子, 四层无菌纱布过滤, 滤液为孢子悬浮液。调整孢子浓度为106 个/m ,l 然后以2% 的接种量接种到装有100m l 液体培养基的500m l三角瓶中, 150r /m in, 28e 培养10d, 四层纱布过滤并10000 @ g 离心20m in, 上清即为粗酶液。将粗酶液冷冻干燥或用聚乙二醇浓缩5~ 20倍后透析除去其中的盐分和色素, 作为待测样品。

1. 3 酶活性和蛋白含量的测定

酶活性测定用DNS ( 3, 5-二硝基水杨酸) 比色法[10] 。1m l磷酸缓冲液( 0. 2mo l/L, pH 4. 5), 0. 5m l待测样品, 0. 5m l胶体几丁质, 混匀, 37e 恒温水浴1h。加入DNS试剂1. 0m ,l 混匀后沸水浴10m in, 冷却至室温, 离心后取上清液在波长530nm 下测吸光度, 重复三次, 取平均值。以100度 高温灭活处理一个酶活力15m in的待测样品为对照。酶活单位定义: 每小时水解几丁质产生1Lmo l还原糖所需的酶蛋白量。蛋白质含量测定用Bradford法, 以牛血清蛋白为标准蛋白测定。

1. 4 电泳方法

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳 。

1. 4. 1 活性凝胶电泳 分离胶浓度为12%, 浓缩胶浓度为4% 。上样量为25Ll。前沿指示剂为0. 5%的溴酚蓝, 以pH 8. 8的T ris-Gly为电极缓冲液。浓缩胶电泳电压为60V, 分离胶电泳电压为80V, 电泳在4度下进行, 当指示前沿距底部0. 5cm 时停止。电泳结束后用磷酸缓冲液( 50mmol/L, pH 6. 0)浸泡5m in。

1. 4. 2 变性凝胶电泳 上样缓冲液中加入4% SDS, 电泳缓冲液中加入0. 1%的SDS, 电泳完毕后将胶置于含1% T riton X-100的磷酸缓冲液中振荡3h, 然后用蒸馏水浸泡5m in。其余处理同活性凝胶电泳。

1. 4. 3 原位显色凝胶电泳 在分离胶中加入0. 5%混有0. 001%荧光增白剂Calcofluor whiteM 2R的胶体几丁质, 加样后进行电泳, 具体的电泳方法同1. 4. 1。

1. 5 显色方法

利用几丁质酶对底物水解后的颜色反应显示凝胶中的几丁质酶条带。显色平板分为以下两种: 一种为0. 5%胶体几丁质, 1. 5%琼脂粉, 0. 001%的荧光增白剂( Calcofluor whiteM2R) ; 另一种为0. 5%胶体几丁质,1. 5%琼脂粉。这两种平板用于活性凝胶电泳和变性凝胶电泳的酶活检测。

变性凝胶电泳中的凝胶用1% 的tritonX-100浸泡3h, 除去其中的SDS, 平整放在两种显色平板上; 活性电泳胶直接放在两种显色平板上; 37e 培养7h。为了让酶尽快渗透到平板上, 在电泳胶片上覆盖约1mm 磷酸缓冲液。37度 培养完毕后, 含有荧光增白剂的平板放到紫外灯下显示黑色条带, 不含荧光增白剂的平板直接在可见光下观察透明带。

对于原位显色电泳, 则在电泳结束后直接将电泳胶浸泡在5mm 磷酸缓冲液中, 37度培养7h, 于紫外光下观察染色谱带。

1. 6 几丁质酶分子量的确定

将活性凝胶电泳中有活性的蛋白谱带切下, 用磷酸缓冲液洗涤3次, 再用蒸馏水洗涤3次, 然后用吸管将胶条表面上的蒸馏水除尽并捣碎, 加入液氮研磨后溶解于适量的磷酸缓冲液中。10000 @ g 离心, 上清即为几丁质酶液。为获得足够量的几丁质酶, 上述步骤可以重复几次。将得到的酶液经冷冻干燥浓缩后, 进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 考马斯亮蓝染色确定几丁质酶的分子量。

2 结果分析

2. 1 电泳样品酶活性测定

绿色木霉LTR-2中几丁质酶产量较低, 直接利用没有浓缩的酶液进行电泳, 无论用何种电泳和检测方法都不能观察到几丁质酶条带, 因此利用冷冻干燥和聚乙二醇浓缩粗酶液。利用DNS比色法和Bradford法测得粗酶液和不同倍数浓缩液的几丁质酶活力及蛋白含量。

2. 2 活性凝胶电泳

活性凝胶电泳结束后, 采用两种显色方法。一是将凝胶直接平铺到含荧光增白剂的几丁质染色平板上, 5倍浓缩的粗酶液经电泳分离后在含荧光增白剂的平板上显色情况如图1所示, 可见两条清晰的活性条带, 根据分子量大小分别命名为CH I65和CH I42; 将同样处理的聚丙烯酰胺凝胶胶片平铺到不含荧光增白剂的几丁质O琼脂平板上, 则检测不到几丁质酶活性, 但将粗酶液进一步浓缩到20倍, 则在几丁质平板上显出明显的条带(图2)。这说明含有荧光增白剂的显色平板灵敏度明显高, 其检测灵敏度可达0. 47U。

2. 3 变性凝胶电泳

5倍浓缩的粗酶液经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并复性后, 在含有荧光增白剂的平板上没有检测到清晰条带; 10倍浓缩液和20倍浓缩液电泳并复性后只显示CH I65一条活性谱带(图3), 说明变性凝胶电泳的灵敏度不如活性电泳凝胶高, 检测到的酶种类减少, 不适合于同工酶谱的检测。

2. 4 原位显色电泳

5倍和10倍浓缩的粗酶液经原位水解电泳后在含有荧光增白剂的平板上基本检测不到活性条带。20倍浓缩液电泳后显色结果如图4。几丁质酶电泳谱带呈弥散形, 并且条带不清晰。这表明, 原位显色电泳可以保持同工酶的活性, 但是需要较大的酶量。

2. 5 分子量的确定

切胶纯化后的几丁质酶经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分别呈现一条单一的谱带, 结果如图5, 两种几丁质酶的分子量分别是65kDa和42kDa。分子量为42kDa的几丁质酶在木霉中普遍存在, 许多文献报道了对该种酶的分离纯化 。而对于分子量为65kDa的几丁质酶在木霉中未见报道, 可能为一种新的几丁质酶。

3 讨 论

在几丁质酶活性研究中应用最多的是变性凝胶电泳。但是该方法有一些不足之处。首先, 变性凝胶电泳结束后要进行复性才能进行酶活性检测, 复性过程中酶的活性有损失, 这将导致一些含量低的几丁质酶同工酶检测不到, 降低了电泳检测的灵敏度; 其次, 一些酶在变性电泳后不能复性, 例如CHIT73在复性后就检测不到活性。本研究中绿色木霉LTR-2的CH I42在复性后也没有检测到活性。

T rudel等曾经报道利用原位水解方法进行几丁质酶检测, 但是这种水解方法需要一种昂贵的乙二醇几丁质来代替胶体几丁质作为反应底物, 并且由于在电泳胶中加入的乙二醇几丁质能部分结合几丁质酶,影响了几丁质酶的电泳速率, 从而使几丁质酶电泳谱带呈弥散形, 很难形成明显的单一电泳谱带。在本实验过程中, 由于在凝胶中加入了不溶性胶体几丁质,它不仅部分结合了几丁质酶, 还形成分子排阻现象, 对几丁质酶的电泳的速率影响更大, 导致在凝胶上看不到清晰的电泳图谱。但是在酶量足够大的情况下, 该方法能够用来检测同工酶的种类, 只是同活性电泳相比灵敏性较差。

活性凝胶电泳在几丁质酶检测过程中应用较少,但是该电泳不需要变性-复性这一过程, 电泳后可直接将凝胶平铺到平板上显色, 减少了丢失酶的可能性。本实验也证实了这一点。在染色方法相同的情况下,活性凝胶电泳的检测灵敏度是变性凝胶电泳的近2倍, 是原位凝胶电泳的4倍, 并且显色清晰。因此活性凝胶电泳适合于分离不同分子量的同工酶。

荧光增白剂CalcofluorwhiteM 2R能和胶体几丁质结合在紫外灯下显示蓝色背景, 当几丁质被分解后失去荧光显黑色条带。由于CalcofluorwhiteM2R的分辨率非常高, 所以广泛应用于荧光显微技术中。据报道利用荧光增白剂进行几丁质酶活性显色的灵敏度可以达到0. 5U 左右[13] 。从本实验结果来看, 显色灵敏度为0. 47U, 与文献报道数据相近, 但是在总酶活相近的情况下利用荧光增白剂显色能够检测到两条活性带, 所以该方法适合于同工酶的检测。

综上所述, 活性聚丙烯酰胺凝胶电泳和CalcofluorwhiteM 2R显色相结合的方法, 在检测木霉几丁质酶同工酶时具有良好的分辨率和灵敏度。采用此种方法,在绿色木霉LTR-2发酵产物中分离得到了两种几丁质酶同工酶, 分子量分别为65kDa和42kDa。该方法简便、快捷、灵敏性高, 是检测木霉几丁质酶同工酶的有效方法。