油菜杂种优势强，增产效果显著，优良的油菜杂交组合一般可增产２０％～３０％，甚至更高。中国每年油菜种植面积在６７０ｈｍ２ 以上，其中“双低”杂交油菜普及率达６０％以上。秦优３３是陕西省杂交油菜研究中心２００８年国审的高油双低化学杀雄油菜杂交品种，优质耐病，丰产稳产，综合性状良好，平均含油量４８％左右，在高油产区含油量达５０％以上。因此，油菜种子质量的优劣就显得非常重要。为预防劣质种子进入市场给农民造成经济损失，有必要且积极地研究建立准确、快速及实用的杂交油菜种子纯度检测方法。通常进行杂种纯度鉴定的方法有３种：田间形态综合标记、室内生化标记及分子标记。前两种方法由于自身条件限制导致应用范围狭窄及能力日渐不足，所以目前各种作物品种纯度分析和鉴定技术已经发展到分子水平。在各种诸如ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＳＳＲ等ＤＮＡ分子标记中，ＳＳＲ标记应用于杂交品种的鉴定和种子纯度检测有其很大的优越性。ＳＳＲ （Ｍｉｃｒｏ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ＤＮＡ 或Ｓｈｏｒｔ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔ）是由几个核苷酸（２～５个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，分布于整个基因组的不同位置上，由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成每个位点多态性。ＳＳＲ标记利用杂交种双亲在其一些位点上的差异，可以将杂交种与其双亲、甚至一些异源花粉造成的杂交种区分开。ＳＳＲ 相比其他分子标记优势如下：（１）数量较为丰富，覆盖整个染色体组；（２）具有多等位基因特性，信息含量高；（３）以孟德尔方式遗传，呈共显性；（４）易于利用ＰＣＲ技术分析，对ＤＮＡ 数量及纯度要求不高，结果重复性好；（５）每个位点由引物序列顺序决定，便于交换。如在小麦、水稻、玉米、大豆、油菜及大麦等中ＳＳＲ 标记都得到广泛的应用。

目前，安全、有效检测ＳＳＲ标记的方法通常为琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳（ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＡＧＥ）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｐｏｌｙａｅｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＡＧＥ）是最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖凝胶电泳的有效分离范围是０．２～２０ｋｂ，聚丙烯酰胺分离小片段ＤＮＡ（５～５００ｂｐ）效果最好，分辨力极高，测序的聚丙烯酰胺凝胶可分离相差１ｂｐ的ＤＮＡ片段。笔者在查看以前资料以及本实验室进行的纯度鉴定工作后，发现纯度鉴定结果检测大部分都是用单一的凝胶电泳检测，没有进行两种电泳检测比较，这样无形中减少引物筛选的数量及降低试验效率，所以本试验对油菜种子ＳＳＲ标记结果分别进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，进而对其检测结果进行比较分析，以期找到不同引物的ＳＳＲ分子标记的合适检测方法，提高鉴定工作效率。

１　材料与方法

１．１　材料

甘蓝型化学杀雄杂交品种秦优３３（Ｈｙｂｒｉｄ，简称Ｈ）及其母本Ｙ１３３（Ｆｅｍａｌｅ，简记作Ｆ）、父本Ｙ７６（Ｍａｌｅ，简称Ｍ）（以下同）。以上材料均由陕西省杂交油菜研究中心提供。

１．２　方法

１．２．１　ＤＮＡ 的提取　参照王灏等和王爱娜等的方法对油菜ＤＮＡ的提取进行改进。步骤如下：取发芽１周龄的单株油菜幼芽置１．５ｍＬ离心管中，加３００μＬ　ＤＮＡ 提取液（５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＡＴ，５００ ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ　ＰＶＰ，φ＝１％ β－巯基乙醇，２０ｇ／ＬＳＤＳ，ｐＨ　８．０）及５０μＬ氯仿，用组织匀浆仪粉碎混匀后置６５ ℃水浴锅水浴３０ｍｉｎ，加入７５μＬ５ｍｏｌ／Ｌ　ＫＡＣ，冰水浴３０ ｍｉｎ 终止反应，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液，加入１ｍＬ－２０℃ 预冷的无水乙醇及７５ μＬ　５ ｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ沉淀ＤＮＡ　３０ ｍｉｎ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，用φ＝７０％ 乙醇洗涤ＤＮＡ 沉淀１次，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，沉淀ＤＮＡ 经干燥后，备用。

１．２．２　ＳＳＲ 分析　候选引物ＳＳＲ 来自ＴｈｅＰｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｒｅ，由上海Ｓａｎｇｏｎ公司合成。

３对候选引物如下：ＳＲ８５Ｆ５′－ＧＧＴＣＧ　ＧＣＡＣＡ　ＡＡＡＡＴ　ＧＴＴＣＴ　Ｔ－３′，Ｒ　５′－ＴＣＧＴＣＡＡＴＣＣ　ＣＧＡＴＡ　ＴＣＡＣＡ－３′ ；ＳＲ３３２ Ｆ ５′－ＧＡＡＧＡ　ＴＴＣＧＡ　ＣＴＣＴＴ　ＴＣＧＧ－３′，Ｒ　５′－ＣＧＴＴＴ　ＣＡＧＡＡ　ＴＣＡＴＡ　ＴＴＧＴＡ　ＴＴＴＴＧＣＴ－３′；ＳＲ４０７Ｆ５′－ＧＣＡＡＡ　ＧＡＴＣＧ　ＧＣＧＡＡ－ＧＡＡＧＡ－３′， Ｒ　５′－ＴＧＣＡＧ　ＡＣＡＣＡ　ＴＴＣＧＡＡＣＡＡＡ

　ＣＡ－３′。

ＳＳＲ反应体系：１０μＬ 的反应体系中含有１．０μＬ　１０×Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ　ｗｉｔｈ （ＮＨ４）２ＳＯ４，０．８μＬ　２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，０．５μＬ　１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，０．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶，２５μｍｏｌ／Ｌ　ＳＳＲ左右引物各０．５μＬ，２５ｎｇ模板ＤＮＡ。

ＰＣＲ　ＳＳＲ 反应程序：９４ ℃ 模板预变性４ｍｉｎ，１个循环；９４℃模板预变性５０ｓ，６４℃退火，引物与模板靶位点结合５０ｓ；７２℃引物沿模板延伸９０ｓ。循环共圈，每一圈退火温度递减１℃；９４℃模板预变性５０ｓ；５６℃退火，引物与模板靶位点结合５０ｓ；７２℃引物沿模板延伸７０ｓ。共２５个循环。７２℃引物沿模板继续延伸１０ｍｉｎ。

１．２．３　电泳检测　琼脂糖凝胶电泳检测：取１０μＬ　ＳＳＲ扩增产物，加１／２体积的上样缓冲液，在３０ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶电泳上１２０Ｖ恒压电泳１．５ｈ左右。电泳完成后，琼脂糖凝胶经１０ｇ／ｍＬＥＢ染色后用凝胶成像仪照相记录分析。

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：取１０μＬ　ＳＳＲ 扩增产物，加１／２体积的变性上样缓冲液，９５℃变性５ｍｉｎ后立即置冰水混合物中快速冷却，然后在６０ｇ／Ｌ的变性聚丙烯酰胺凝胶上３００Ｖ恒压电泳１．５ｈ左右。电泳完成后，变性凝胶经纯水漂洗３～５ｍｉｎ后用１．５ｇ／Ｌ的硝酸银溶液染色１０～１５ｍｉｎ，再次经纯水漂洗变性凝胶１５ｓ后用１５ｇ／Ｌ的ＮａＯＨ和φ＝０．４％甲醛溶液显色到条带清晰显现，纯水漂洗、风干，数码相机照相记录。

１．２．４　两种电泳标准谱带对比　将混匀充分的秦优３３杂交种及其父母亲本种子在培养皿中发芽，在１周左右分别选取杂交种及父母亲本各１２０株单株提取ＤＮＡ，提取方法参考“１．２．１”。

用提取的秦优３３杂交种及父母亲本的单株ＤＮＡ各１２０株混合样对候选引物进行扩增，扩增结果分别用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，建立ＤＮＡ标准图谱。

１．２．５　两种电泳验证候选ＳＳＲ引物在杂种纯度分析中一致性和可靠性对比　将“１．２．１”提取的高纯杂种及其父母亲本各１２０单株的ＤＮＡ，用候选引物进行扩增，扩增结果分别用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，将各自扩增的ＤＮＡ图谱与其标准图谱进行对比。

２　结果与分析

２．１　两种电泳分离候选引物扩增结果的标准图谱

种子纯度鉴定目的就是利用筛选的候选引物将杂交种与其父母亲本区别开来。从前人文献及本研究积累总结出一般杂交种与父母亲本间的带型表现大部分出现以下５种类型：偏母型、偏父型、互补型、同有型和杂种型。在这５种类型中杂种与父母亲本间带型互补型是杂交种的带型为父母亲本特征带型的互补，杂交种、父本及母本三者带型表现完全不同，所以此类型是进行杂种纯度鉴别的理想类型。本试验用３ 对候选引物ＳＲ８５、ＳＲ３３２和ＳＲ４０７对高纯的秦优３３杂种及两亲本的单株ＤＮＡ 各１２０株混合样进行扩增，扩增结果见图１。

　３对候选引物在琼脂糖凝胶电泳上所扩增的ＳＳＲ－ＤＮＡ片段最多的为引物ＳＲ４０７，杂交种扩增出３条带，父母两亲本分别扩增出两条带，３个条带中最小的带为父母亲本及杂交种的共有带。

引物ＳＲ８５及ＳＲ３３２父母亲本都扩增出一条带，杂交种为两者互补带。从图１－Ａ 可以看出，引物ＳＲ８５、ＳＲ３３２和ＳＲ４０７所扩增的条带都表现为杂种条带为父母本条带的互补带型，但是引物ＳＲ８５和ＳＲ４０７所获互补片段大小较近，杂种条带间易于粘连，鉴定品种纯度容易将杂种、父母本混淆，引起结果偏差。而引物ＳＲ３３２所获的两条互补条带的迁移率相差很大，小条带小于１００ｂｐ，大条带大于２５０ｂｐ，所以品种鉴定中，在琼脂糖凝胶电泳水平上利用ＳＲ３３２引物鉴定秦优３３杂种纯度完全可准确清晰地实现甄别，不仅比聚丙烯酰胺凝胶电泳缩短半小时以上的时间，而且省去繁琐的银染过程及其相关药品的消耗，既节约成本，又提高效率。

但在区别片段差异小于５０ｂｐ甚至１０ｂｐ以下时，琼脂糖凝胶电泳结果常常会出现诸如ＳＲ８５和ＳＲ４０７引物分析结果那样，不易或不能分辨差别，难以实现差异鉴别。而聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的片段差异理论上可达１ｂｐ，分辨力明显提高，很多在琼脂糖上显示只有１条ＤＮＡ片段的，被聚丙烯酰胺凝胶电泳分离成两条，甚至更多。从图１－Ｂ可以看出，３对候选引物扩增的ＳＳＲＤＮＡ片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的条带数目比琼脂糖凝胶电泳分离的多。其中引物ＳＲ８５利用两种电泳分离的条带数目一样，而且标准图谱都表现为杂交种条带为父母亲本条带的互补。

其中引物ＳＲ３３２有５个条带，父本和杂种的带型一致，５个条带皆有，而母本只有４个条带，所以此引物扩增的ＳＳＲ－ＤＮＡ片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中只能区别母本和杂交种及父本，而不能将杂种与父本区分。引物ＳＲ４０７ 所扩增的ＳＳＲ－ＤＮＡ片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离显示的条带数目要比琼脂糖凝胶电泳分离的条带多１０个。如图１－Ｂ，杂交种的条带表现为父母本的互补带型，其中ａ、ｂ、ｃ条带为杂种互补条带中母本的特征条带，ｆ、ｇ、ｈ条带为杂种互补条带中父本的特征条带，ｄ、ｅ条带为杂交种独有的杂种带，ｉ条带为父本的特征带，但不是杂交种的互补带，其他条带均为杂交种及父母本的共有带。从图１－Ｂ可见，ＳＲ８５及ＳＲ４０７条带清晰，条带之间分离清楚，可以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离方法进行杂交种纯度鉴定。

２．２　两种电泳验证目标ＳＳＲ引物在杂种纯度分析中的一致性和可靠性由“２．１”可知，３对候选引物在琼脂糖凝胶电泳下的标准谱带表现其杂种带型皆是双亲互补带型，在聚丙烯酰胺凝胶电泳下两引物ＳＲ８５和ＳＲ４０７的标准谱带表现其杂种带型也是双亲互补带型，但引物ＳＲ３３２上的杂种带型表现却是偏父带型。所以，用引物ＳＲ８５和ＳＲ４０７分析，无论选用琼脂糖凝胶还是聚丙烯酰胺凝胶，皆可有效进行纯度鉴别，而引物ＳＲ３３２只可用琼脂糖凝胶电泳分析。

　　利用ＳＳＲ 进行种子纯度鉴别，虽然稳定性好，可靠性高，操作简便，但ＳＳＲ标记分布在整个基因组，多态性异常丰富，因此，即使是同一品种（系）的不同单株之间也可能存在多态。为了避免一些候选引物在目标样品单株分析过程出现较多甚至超出显著水平的不一致性，需将候选引物在亲本和杂交种的大量单株间进行一致性和稳定性验证。为此本试验用候选引物对杂种及其双亲的大量单株在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质进行电泳分析和验证，比较其一致性和稳定性。图２和图３显示，３对候选引物在杂种和双亲中的各个高纯单株中的带型表现无论琼脂糖凝胶电泳结果还是聚丙烯酰胺凝胶电泳结果与标准带型皆完全一致。同样琼脂糖凝胶电泳结果在ＳＲ８５和ＳＲ４０７两引物的分析结果尤其杂种带型显示中，因带条距离接近而使结果的判断认定比较费力，而引物ＳＲ３３２在琼脂糖凝胶水平的表现无疑最佳。同时在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果上，ＳＲ３３２不能将父母双亲和杂种三者一次区分开，而达不到分析目标，但ＳＲ８５和ＳＲ４０７两引物在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果上的显示效果非常理想，条带清晰稳定，差异分明显著，结果准确可靠，表明不同的引物应选用合适的电泳介质，才能达到理想的鉴定效果。

３　讨论

在种子生产利用中，面对当年收获当年用种的要求，一般种子纯度的室内检测应具备技术稳定、测定快捷、结果准确及重演性强、成本在一个可承受的范围，并在不影响结果的前提下，越低越好。本试验同时在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种电泳分离介质上对油菜杂交种秦优３３进行杂种纯度分析检测效果比较，结果表明两种介质都是用ＳＳＲ技术进行种子纯度分析的有效方法。

但因两种介质的分子结构、交联状况及其浓度大小变化形成的分子筛孔径不同，两者的分离范围和分离精度存在较大差异，琼脂糖凝胶的质量浓度一般在４０ｇ／Ｌ 以下，形成的凝胶孔径相对较大，其片段的分离精细度一般较低，只有达到几十个ｂｐ以上较大长度差别时，分辨才会很清晰，但其区分的片断长度范围大，从几万个ｂｐ到几十ｂｐ都可有效实现电泳分离。而聚丙烯酰胺凝胶一般使用质量浓度为５０～８０ｇ／Ｌ，其分子交联度高、分离筛孔小，甄别的精细度高，小到１ｂｐ的碱基差异都可以区分，分辨力强，但片段分离范围较窄，一般在５００ｂｐ以下。两种介质依据分离目标片段的大小和差异长短，配制成不同质量浓度的凝胶对应进行分离分析。所以，不同的介质即使对同一扩增产物，其分离后的带型结果表现可能不尽一致，一些结果带型可能基本一样，如本研究中的ＳＡ８５，双亲及其杂种在两介质上皆总共获得两条共显性标记条带，只是聚丙烯酰胺凝胶电泳结果区别更清晰。另外一些结果则完全不同，如ＳＡ３３２和ＳＡ４０７，在琼脂糖凝胶电泳结果中，ＳＡ３３２有两条差异显著的共显性标记表现，能使父母及杂种三者皆可清晰鉴别，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中条带数虽增加至５条，但却只有一个差异位点，所以无法甄别３个材料，不能用于纯度分析；ＳＡ４０７在琼脂糖凝胶电泳结果中３个材料共显示３条带，有两个差异带位，但因差异带条相距太近，易于粘连混淆，给判定增加困难，用于鉴别稍显欠缺，而ＳＡ４０７在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果上有１３条带，有８个差异带位，可清楚鉴别三者关系。所以在ＳＳＲ用于杂种纯度分析过程，所用引物不同选用的对应介质也应不同，一些引物分析结果可能适合琼脂糖凝胶电泳分离，一些则可能更适合聚丙烯酰胺凝胶电泳，一些可能两者皆适合，需要在两介质上分别对应筛选，通过比较验证进而获得最佳分析途径。

与此同时，虽然两介质皆是进行杂种纯度分析的有效途径，但在可实现目标的前提下，从成本和效率角度出发，无疑琼脂糖凝胶电泳是首选，因为琼脂糖凝胶电泳操作简单，制胶便捷、分析样品不需事先处理、电泳速度快，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定，电泳后区带染色直接，比聚丙烯酰胺凝胶电泳后续繁琐的银染过程优势显著，尤其是聚丙烯酰胺凝胶电泳所用聚丙烯酰胺凝胶是一次性的，不能重复利用，而笔者课题组在琼脂糖凝胶进行纯度检测时有效解决琼脂糖凝胶的重复利用问题，可回收利用多次，加上所节约的较为昂贵的银染花费，无疑使分析成本得到显著节约。

但从引物筛选效率或从备选引物库里获得可用于鉴别的引物机率上，聚丙烯酰胺凝胶更有优势，因为其分辨力更高，针对ＳＳＲ片段总长几百碱基以下，差异一般在几个到几十个碱基之间。本课题组从秦优７号、秦杂油１号、秦杂油３号和秦杂油１９等各个品种的目标引物筛选过程中也充分验证了这一结果。