造成透射光强I t 变化的除散射、介质的吸光, 还有界面间的反射、透射损耗等, 这些都会造成偏离朗伯-比尔定律, 下面针对这些因素造成的

影响进行一定的分析。

3. 1 正入射光线对透射光强的影响分析

当电磁波从一种介质传播到另一种介质时,由于介质表面的物理性质不同, 造成电磁场在界面上不连续[ 6, 7] 。由菲涅耳相关理论可以得知,

当入射角小于45b时, 反射比Qn 几乎不变, 与正入射时相近[ 6] , 其反射比Qn= n- 1n+ 12, ( 2)其中n= n2 / n1 ,在本设计中, 透过样品池的光线几乎是正入图5 样品池的光学特性Fig. 5 Sample cell. s o ptical char acteristics射, 入射角均小于45b, 光学特性如图5 所示。在两界面上的反射率均为Qn , 因光在界面1 上的反射造成的入射光强变化值:

3. 2 倾斜光线对透射光强的影响分析

后分光光度计对宽光谱段进行准直时, 由于像差的存在, 透过样品池的光线必然倾斜, 下面就倾斜光线对透射光强的影响进行分析。样品池可以看作一个平行平板, 如图5 所示。由平行板的侧向位移[ 7]式中, n1 样品池侧壁的折射率、n 2 为待测介质的折射率、d 是样品的沿光线传播方向的距离。可见, 对侧向位移$T 和轴向位移$L 有影响的参数有n1 、n2、I 1和d, 在实际的分光光度计中, d 是固定的, 大多数的分光光度计的d 为10 mm, 小型化的仪器为6 mm 左右。对系统的光强变化有直接影响的是侧向位移$T , 仅对$T的影响参数进行一定的分析。$T 随着n2、I 1 的

变化的关系曲线如图6 所示, 其中样品池的折射率n1 = 1. 45, d = 6 mm。

由图6 中可以看出:

A. 当被测试介质( 液体或空气) 的折射率n2和样品池的折射率n1 的相差越大时, 光斑的侧向位移越大。

B. 当光线倾斜角I 1 越大, 光斑的侧向位移越大。对于一个已经制备好的分光光度计而言, I1已经固定, 由公式( 9)、( 10) 和图6 看出, 任何和样

品池折射率不同的介质都会造成光斑的侧向位移, 但是当参比介质的折射率和被测试介质的折射率接近时, 会使得两者的侧向位移相近, 但是实

际测试中很难找到两种折射率一致的物质, 因此需要分析侧向位移对透射光强的影响。假设出射光斑的光照度( 光强) 沿径向方向是均匀分布, 且

本系统中近轴视场光阑和光斑的初始位置重合,如图7 中白色光斑所示。

图7 透射光斑的侧向位移原理图Fig . 7 Schematic diag ram o f the tr ansmit ted lig ht

当有侧向位移时, 就会有部分光斑/ 溢出0, 从而造成光强的变化, / 溢出0部分如图7 中阴影部分所示, 其面积经数学推导结果为

光斑的总面积

S= PR2 , ( 12)/ 溢出0部分光斑势必会造成能量的变化, 能量的变化率就可以简单地表示成/ 溢出0部分光斑面积和总面积的比值, 即

根据上式作出透射光强的变化率和光线的侧向位移$T 、光斑的半径R 的关系图, 如图8 所示。其中$T 在- 1~ 1 Lm 之间变化, R 在0. 2~ 10 mm

之间变化。图8 $I t2 / I t 和$T, R 关系图Fig . 8 Relation betw een $T, R and $I t2 / I t由图8 可以看出$T 越小、R 越大则$I t2 / I t越小。三者之间存在制约关系, 任何一个参数的选择应该综合考虑其它两个参数的变化是否在系统的承受范围之内。但是从图8 中可以看出一系列明显的拐点, 即变化的陡峭点。这些拐点是仪器的微型化与仪器光学性能之间的一个平衡点,是参数优化配置的一个重要参数。由图8 中可以看出, 当R= 1mm, $T = 1 Lm 时, $I t2 / I t 会突然变化, 此点即为拐点之一。

3. 3 光强变化对吸光度的影响

当入射光强I 0 变化$I 0 , 透射光强I t 变化vI t 时, 对应的吸光度A 变化$A 时, 那么朗伯-比尔方程变为A+ $A= log( I 0- $I 0 ) - log ( I t- $I t ) , ( 15)上式微小量$I t 、$A 求微分整理得:由上述分析可以有下推论:

( 1) 由于参比溶液的折射率和被测试介质的

折射率不同, 必然造成吸光度和浓度之间的关系拟合曲线(A-C 曲线) 不过原点, 两者相差越大, 与原点的距离$A 越大。( 2) 仅对各个点的A/ 平移式0增加, 即采用不同的参比溶液, 两者之间的平移量不同, 但是不会对线性度、A-C 曲线斜率有影响。

( 3) 在入射光强相同并且被测介质一般吸收,当被测试介质的折射率和样品池的折射率越近,透射光强越大。当两种被测介质的透射光强相比时, 透射比是否超过100%, 取决于两者的折射率和样品池的折射率的接近状况。

4 吸收光谱实验和分析

4. 1 介质折射率不同的透射光强的测试用所研制的微型分光光度计测试三种不同折射率的介质的光谱如图9 所示, 其中三种介质在K= 750 nm 附近属于一般吸收。由图9 可以看出, 三者的透射光强关系为I tA ir < I tWater < I tCoCl2 ,具体数据见表1, 随着被测试介质折射率和样品池的折射率的接近, 透射光强I t 也增加, 验证了

3. 3 中论述和分析。此现象已经超越朗伯-比尔

定律的解释范围, 但是属于正常的测试现象。同时可以利用此规律测试未知介质的折射率, 表1可以看出, 本系统可以测试折射率相差0. 01 的两

种介质。图9 不同介质在750 nm 附近光谱Fig. 9 Spectr um o f different medium near 750 nm表1 不同介质的折射率和透射光强

4. 2 线性吸光度溶液的测试和分析

线性吸光度溶液采用的国家标准物质中心调配的CoCl2 稀酸溶液[ 8] , 吸收光谱如图10 所示,其中参比溶液为蒸馏水。由图10 可以看出体系的测试吸收峰值和理论值510 nm 基本吻合。当相对浓度较大时, 溶液的吸光度也较大, 由布格-朗伯-比耳定律知透过溶液的辐射强度将会很弱,此时系统的随机噪声对系统的的测试影响较大,故图10 中吸光度较大时吸光度的工作曲线不平滑。当选择不同参比溶液时, CoCl2 吸光度值如表2 所示。可见由参比的不同造成了吸光度的不同, 对A-C 曲线的线性度影响见下面分析。图10 CoCl2 吸收光谱

Fig . 10 CoCl2 absor bing cur ves表2 CoCl2 吸光度数据表Tab. 2 Abso rbency of CoCl2

3. 2 0. 268 94 0. 178 60

8. 0 0. 671 36 0. 575 80

10 0. 837 79 0. 748 77

14 1. 192 74 1. 113 39

18 1. 509 01 1. 416 22

对A-C 曲线进行一元线性回归, 令其方程式为y^ = a+ bx , ( 19)式中y^ 为吸光度回归值, x 为相对浓度值, a、b 为回归系数, 其具体表达式参见文献[ 9] 。把表2 中的数据带入文献[ 9] 相关公式, 计算的结果如表3所示, 其中r 为相关系数, R为残余标准差, N-2 为自由度。也可以利用origin 软件进行相关计算和绘图, 做出的直线拟合曲线如图11 所示。由表3和图11 可以看出, 尽管以空气为参比时的吸光度整体都比水为参比时的吸光度小, 但是线性相关系数r 和A- C 直线斜率b 几乎一样, 进一步说明了因被测介质折射率变化引起的透射光强的变化对系统的吸光度A 的影响仅仅限于$A , 并且当参比介质和被测介质的折射率越接近, $A 越小,如表3 中a 值。同时说明参比介质和被测介质的折射率越接近时, A-C 曲线将是一条过原点高度线性相关的直线, 且相应的回归残余标准差越小(R= 0. 009 31) 。对于一元线性回归方程而言, 当自由度为3、显著水平为0. 001 时, 其临界值

r( 0. 001; 5- 2) = 0. 991 2[ 10] 。本系统中r >r( 0. 001; 5- 2) , 故系统的线性相关性为高度显著相关。

图11 CoCl2 工作曲线Fig. 11 CoCl2 w or king curves表3 CoCl2 吸光度线性拟合表Tab. 3 Linear fit Abso rbency of CoCl2Pa rameterAbso rbency

( Water as Refer ence)Absorbency( Air as Refer ence)

a - 0. 000 81 - 0. 092 86

b 0. 084 28 0. 084 53

r 0. 999 86 0. 999 59

R 0. 009 31 0. 015 79

N- 2 3 3

5 结 论

基于MEMS 技术研制出了具有体积小、分辨率高、高度线性相关的微型分光光度计。采用MEMS 技术的微硅片狭缝、微定位器, 具有体积小、精度高、易于批量化制作的特点, 克服传统机械加工的诸多缺点。通过对样品池光学特性的进行分析, 论证了被测试介质的折射率对透射光强和吸光度的影响, 为相关的实验测试提供了理论指导。最后通过对透射光强的测试结果表明, 该微型分光光度计可以分辨出折射率相差0. 01 的两种介质, 为该系统在测试分辨率方面提供了应用前景。同时通过测试以空气和蒸馏水为参比溶液时CoCl2 稀酸溶液的吸光度, 进一步验证了关于被测介质折射率变化对吸光度A 的影响, 仅仅限于$A , 而与A-C 斜率无关, 并且结果显示两者的相关系数r 都大于0. 999, 属于高度显性相关,这为基于MEMS 的微型生化分析仪提供了一个高度线性相关光度分析平台。尤其是光纤和MEMS 技术的结合, 为微型分光光度计远程式、网络化、无线操作、实时动态在线监测、数据的共享等提供了广阔的应用空间。