超氧化物歧化酶( EC1-15.1.1, 简称SOD)是广泛存在于生物体内的一类金属酶, 根据金属辅基的不同可分为Mn-SOD、Fe-SOD 和CuZn-SOD 3种类型, 近年来还从链霉菌属中发现了N i-SOD, 从日本沼虾中纯化66.1 ku的EC-SOD, 发现了仓鼠和人胞质中的240~ 260 ku及135和270 ku的EC-SOD , 它们都具有催化超氧阴离子自由基形成过氧化氢和水的反应能力, 在防御活性氧对生物体的伤害、在植物的逆境生理、在预防和治疗由自由基诱发的一系列疾病, 如肿瘤、辐射损伤、心脑血管疾病等方面都起到了很重要的作用. 对3种类型SOD同工酶的分离和鉴定是生物学和医学中会遇到的实际问题, 通常都是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE )的定位染色法 , 我们在实际应用中发现样品点样量少时, SOD 弱带难以显示,点样量大时植物次生物质对酶带显示有干扰, 且谱带清晰度和重复性都不理想, 时有谱带重叠现象出现,谱带分离的Rf值与酶类型间无特定规律可寻, 在改用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳( GPGE )后得到了较满意的效果. 本文将通过GPGE和PAGE 的比较, 旨在建立用GPGE 分离和鉴定SOD同工酶的新方法.

1. 材料和方法

1.1 材料、主要试剂及仪器

新鲜的植物材料采自南京地区和本院温室, 当天采集后, 用蒸馏水洗净后备用.枸杞Fe-SOD、牛血SOD及花生CuZn-SOD分别按其文献 纯化至电泳纯. 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、甲硫氨酸( Sigma) , NBT(南京卓尔生化有限公司), 其它试剂为国产分析纯或生化试剂. 主要仪器为岛津CS- 9000双波长薄层扫描仪, CSR- 4高压电泳仪, 梯度凝胶电泳灌胶装置.

1.2 方法

1.2.1 SOD粗酶液的制备

将实验材料剪碎, 按每克鲜重加入3mL 的50mmo l/L 磷酸缓冲液( pH7??8) 进行研磨匀浆, 匀浆液10 000 r /m in离心15m in后, 上清液即为粗酶液, 用于实验或分装于小离心管内, - 25?? 保存备用.

1.2.2 SOD同工酶的电泳分离和染色定位

PAGE 按罗广华等 方法, 在7.5%或10% 的分离胶上进行; GPGE 按程光宇等及张龙翔方法, 在4% ~ 35%梯度胶上进行, 加样前以100 V稳压预电泳30m in, 加样后在4 电泳, 先以150V 稳压电泳1 h后, 将电压逐步提高到300V 稳压电泳15 h(电泳持续4 500 V  h以上) ; 二次电泳按程光宇等[ 9] 方法进行, 第一向为10%的PAGE, 在电泳结束后切取具有SOD 活性且未经染色的区带, 放在已预电泳过的4%~ 35%梯度胶上端, 加入PAGE 中3??5%的浓缩胶液, 采用光照聚合将其固定后进行第二向GPGE, 同时以相同酶液量在梯度胶上点样. 电泳结束后进行酶活性染色, 采用拍照或扫描方法记录SOD 同工酶图谱.

1.2.3 SOD同工酶类型的鉴定

( 1) 参照Bridges和Sa lin 的方法[ 10] , 以KCN 和H2O2 两种抑制剂鉴定SOD类型.

( 2) 利用梯度胶具有分子筛效应[ 8] 及其Rf 值与3种SOD相对分子质量存在差异 的特点, 由Rf 值初步判断SOD类型.

( 3) 利用CuZn-SOD 对SDS不敏感、Mn-SOD 和Fe-SOD 对SDS敏感的特性, 向粗酶液中加入SDS溶液使其终浓度达1%后, 于37 保温1 h, 分别进行SOD 同工酶的GPGE 和PAGE 并进行酶活性染色. CuZn-SOD 对SDS不敏感, 谱带留存, Mn-SOD和Fe-SOD 对SDS敏感, 谱带消失.

2 结果与分析

2.1 GPGE 和PAGE对分离SOD同工酶的影响

结果见图1. 14种植物的3种类型SOD在4% ~ 35%的梯度胶中都得到较好的分离, 谱带清晰, 未见有干扰现象, 根据Rf 值可分为A、B、C 3个区域: A区的Rf 值最小( < 3.6) , 谱带都为1条; C 区的Rf 值最大( > 5.0), 其中谱带数目因植物种类不同而异, 如羊蹄、拔契仅有1~ 2条, 而鸭趾草、马兜铃等则多于4条; B区Rf值位于A、B区之间, 如有谱带一般都为1条, 但许多植物缺乏这种类型谱带. 同时, 从其Rf 值大小, 还可初步判定各同工酶的相对分子质量和类型, Rf 值最小的A 区同工酶相对分子质量最大, 应为Mn-SOD; Rf最大的C 区同工酶相对分子质量最小, 应是CuZn-SOD; 而介于两者之间B 区的同工酶可认为是Fe-SOD, 如南苜蓿、金荞麦的Fe-SOD. 在SOD 类型的筛选中, 利用梯度胶这一分离特性为初步判断SOD类型提供了一条快捷途径.同一样品在相同加样量下进行10% PAGE, SOD 谱带分离效果远不如GPGE, 谱带分布及Rf 值与SOD类型之间无特定规律可寻, 其中紫花地丁中的次生物质对SOD 显示干扰并影响到周围的谱带(图1的11) . 可见, 在PAGE 中SOD 的Rf 值因受电荷、胶浓度、pH值等多种因素影响, 不能作为SOD类型鉴定的依据, 在GPGE中的Rf 值排除了电荷等因素的影响, 与分子大小有相关性, 故它可用于测定天然酶和蛋白质的相对分子质量.

2.2 GPGE 和PAGE检测SOD的灵敏度和分辨率比较

以牛血SOD为标准, 比较GPGE 和PAGE检测SOD的灵敏度和分辨率(见图2). 当以相同加样量分别进行GPGE 和PAGE时, 在PAGE图谱上SOD的检测浓度为1.56  10- 13mo,l 在GPGE 图谱上, SOD浓度为1.56 10- 14mo l时谱带清晰, 当再稀释10倍后仍能见到SOD 谱带(图片未列出) , 说明PAGE 和GPGE 检测SOD的灵敏度分别为156  10- 13mo l和1.56 10- 15mo.l 在GPGE 图谱中牛血SOD活性染色与蛋白染色带边缘清晰, 呈扁平状, 在1.56  10- 12mol SOD 时活性染色带可分辨出1条主带和2条次带及1条弱带(图2中A 3) , 与6.24  10- 9mo l SOD时的蛋白带相互对应(图2中B5); 而在同样加样量下的PAGE 图谱中谱带边缘模糊, 只能分辨出1条主带和1条次带(图2中C10). 说明GPGE 比PAGE 有更高的分辨率.

花生SOD粗酶液( 125 U /mL)分别以1 ??L进行GPGE 和PAGE 时, 在GPGE 图谱上Mn??SOD和CuZn??SOD谱带非常清晰(图2的13) , 但在PAGE图谱上已无明显的谱带(图2的19) . 花生CuZn-SOD 在GPGE中分别加样0.016 g和0.128 g, 在PAGE 中分别加样0.032 g和0.32 g时, 低、高浓度SOD谱带扫描后峰面积之比分别为1??3??37和1??1??54. 从图1和图4还能看出南苜蓿、番茄、金荞麦等在梯度胶上显示出4~ 5条带, 但PAGE图谱上显示2~ 3条. 纯化的枸杞Fe??SOD有3条带, 但在GPGE 上的灵敏度和分辨率明显高于PAGE(图3的4, 9) . 可见, 对于植物的粗酶液和纯酶, GPGE 同样比PAGE 有较高的灵敏度和分辨率.

2.3 不同胶浓度对3种SOD类型分离和鉴定的影响

枸杞和香橼都含有3种类型SOD, 它们在不同胶浓度下的分离结果见图3. 枸杞在7-5% PAGE 中有3条Fe-SOD, 它们的Rf 最大, CuZn-SOD也有3条, 它们的Rf 居中, Mn-SOD 不成条带, 很难确定. 在10%的PAGE 中3条Fe-SOD 带上移已与第三条CuZn-SOD 相重叠, Mn-SOD 带已能基本分清. 同时可见在7-5%和10%的PAGE 中还存在CuZn-SOD 抑制不完全的现象, 经KCN和H2O2 处理后在负极处的一些谱带性质也很难判断; 在4% ~ 35% 的梯度胶中3种类型SOD 谱带完全分离, Fe-SOD 带上移至Mn-SOD和CuZn-SOD间, 与纯化的Fe-SOD 有相同的Rf值. 香橼SOD 在10% 的PAGE 中, 有1条对KCN 和H2O2 都敏感的CuZn-SOD谱带, 它的Rf 值最小, Mn-SOD和Fe-SOD 即使以抑制剂处理, 也因未分离开和分辨率差无法判断. 在4% ~ 35%的梯度胶中3种SOD 同工酶都有规律地完全分开, Rf 值最小的1条为Mn-SOD, Rf值较大的2条为CuZn-SOD, Rf值位于两者之间的为Fe-SOD.

可见, 枸杞和香橼的3 种SOD 类型, 它们在7??5% 和10% 的PAGE 中分离难有规律可循, 如香橼CuZn-SOD的Rf 值在同工酶中最小(图3D) , 同为Fe??SOD, 在枸杞中的Rf 值最大(图3A ), 在朱桔中Rf 值却最小(图5A ). 当用KCN 和H2O2 鉴定SOD 类型时, 常有抑制不完全的现象, 有的因谱带重叠, 即使采用抑制剂也很难有结果, 如香橼的Fe-SOD、Mn-SOD(图3D )和朱桔的Mn-SOD、CuZn-SOD (图5A ) . 但在4%~ 35% 梯度胶上, 如存在Fe-SOD时, 其Rf 值总是位于Mn-SOD 和CuZn-SOD 之间, 枸杞、香橼和朱桔3种类型SOD 在梯度胶上均有此规律可寻. 在梯度胶中以其Rf 值大小判断SOD 的类型的结果与用抑制剂处理的结果完全一致, 利用这一特点我们发现了许多高等植物含有Fe-SOD，

2.4 SDS处理对在GPGE和PAGE 中SOD类型鉴定的影响

样品经1% SDS处理后, 以相同量分别进行GPGE 和PAGE, 结果见图4. 在梯度胶中, 7种植物在A区的SOD 谱带活性都被SDS抑制, 无一例外, 表明它们都是Mn-SOD; C 区的SOD 谱带对SDS不敏感, 为CuZn-SOD, 其中金荞麦和还亮草都含有1条对SDS敏感的谱带, 但它们经KCN 和H2O2 处理谱带消失, 具有CuZn-SOD的典型特征, 这些谱带的Rf 值在经SDS 处理前后一致. B 区带中被SDS 抑制的为Fe-SOD,其中代代花和南苜蓿的Fe??SOD的含量大于30% , 金荞麦、马兜铃、无花果、三叶草都含有对SDS 敏感的Fe-SOD(结果待发表). 经SDS处理后留存的为CuZn-SOD, 而Mn-SOD 和Fe-SOD 谱带消失, Mn-SOD 和Fe-SOD的区分则可根据它们在GPGE 图谱上的Rf值确定. 由此可见, GPGE 结合SDS处理是SOD类型鉴

定的有效途径之一.

在PAGE 图谱上经SDS处理后, 有的谱带活性基本不变, 如2、6和12, 有的出现了一些新谱带, 如37、9、13、15, 可能是CuZn-SOD 与Mn-SOD、Fe-SOD 重叠所致或是经SDS处理改变了SOD 电荷性质. 番茄在梯度胶B 区有2条对SDS敏感的SOD 谱带(图4中17), 证实了它存在Fe-SOD , 但在PAGE 上经SDS处理后未发现Fe-SOD, 显然在PAGE 中经SDS处理不适合于植物粗提液中SOD类型判定.

2.5 SOD谱带在GPGE和PAGE 中的相互关系

结果见图5. 朱桔在二次电泳(图5C)中的a、b带对应于GPGE图谱上的a、b带(图5B )和PAGE 图谱上的a、b带(图5A ) , 分别为Mn-SOD 和Fe-SOD, 但在PAGE图谱上a带Rf 值大于b带; c带有2条为CuZn-SOD, 在二次电泳和梯度胶中是相互对应, 但在PAGE 图谱上a、c带混杂, 从纯化的Mn-SOD 和CuZn-SOD 的PAGE 图谱上可看出a、c是重叠带. 在二次电泳中新、老叶中Fe-SOD活性都约占SOD 总活性的30%, 与GPGE 中的结果相当, 但在PAGE 中老叶这一比例约30% , 新叶低于5%.

从二次电泳中SOD 谱带在PAGE 和GPGE 中的对应关系可看出, 朱桔3种SOD 类型在GPGE中能按照分子大小有效地分离和鉴别, 但在PAGE 中SOD谱带有重叠现象, 分离不彻底, 新叶中的植物次生物质干扰了SOD活性显示, 甚至无谱带.

3 讨论

目前国内外在SOD同工酶的分离和鉴定研究中都是采用10%左右的PAGE, 但分离效果和图谱都不很理想. 我们在枸杞果实SOD 研究中采用了GPGE, 并首次报道了枸杞含有Fe-SOD , 在随后的研究中陆续发现了何首乌、香橼等十几种高等植物存在Fe-SOD . 迄今为止国内外报道含Fe-SOD 的高等植物仅

番茄、银杏、睡莲、芸苔、樟树等十几种 , SOD 同工酶的分离也都是采用PAGE, 我们的发现与用

GPGE 替代PAGE 研究SOD 电泳技术改进密切相关, 但对GPGE 分离和鉴定SOD 类型和SOD 谱带在GPGE 与PAGE中相互对应关系的研究国内外尚未见报道, 本文对此进行了初步探讨.

3.1 GPGE 比PAGE能更有效地分离和鉴定SOD同工酶类型本研究表明, 在GPGE图谱上的SOD 谱带可明显分为A、B、C 3个区, A 区Rf 值最小, 对SDS敏感, 为分子量最大的Mn-SOD; C区Rf值最大, 对SDS不敏感, 为相对分子质量较小的CuZn-SOD; B区的谱带Rf值位于二者之间, 经SDS处理后消失, 为Fe-SOD. 由于GPGE 是根据孔径大小分离酶和蛋白质, 其Rf 值与SOD分子大小有相关性 , 使酶的分离和鉴定变得相对容易和简单化, 当结合SDS处理时能将CuZn-SOD

和Mn-SOD、Fe-SOD区分开, 由于Fe-SOD 的Rf值通常位于Mn-SOD 和CuZn-SOD间, 故可确定SOD 类型.

本文中枸杞、朱桔、香橼存在的3种SOD 类型符合这一规律, 当采用KCN 和H2O2 对枸杞、香橼、金荞麦和还亮草等SOD类型进行鉴定时, 结果与GPGE 中各谱带Rf 值与SDS 处理相结合来确定酶类型的结果一致, 说明了将GPGE 中各谱带Rf 值与SDS处理的结果相结合是分离和鉴定SOD类型的一种简便有效的新方法. 在传统的PAGE 中SOD 谱带受其所带电荷、分子大小、胶浓度等多种因素影响, 分离的Rf 值变化较大, 如本文中Fe??SOD 的Rf 值在枸杞中最大, 在朱桔中最小, Rf 值与SOD 类型及分子大小间无特定规律可寻, 鉴定SOD 类型要采用KCN 和H2O2 等抑制剂, 由于KCN为剧毒品, 使SOD类型的研究受到了限制,当酶带相互重叠时甚至无法有结果(如香橼、朱桔等) . 可见, 在SOD分离和类型鉴定方面GPGE 比PAGE有更大的优势和应用前景.

3??2?? GPGE 分离SOD的灵敏度和分辨率

本文对GPGE 和PAGE检测SOD 的灵敏度和分辨率进行了比较, 结果表明, PAGE 检测牛血SOD灵敏度为10- 13mo ,l GPGE检测牛血SOD 灵敏度可达10- 15 mo.l 由于GPGE 的灵敏度比PAGE 高2个数量级, 可检测到在PAGE 图谱上因含量很低难以显示或活性低于5% 的Fe??SOD 谱带(如马兜铃、无花果三叶草等) , 它们的Rf值都位于Mn??SOD和CuZn??SOD的B 区之间. 在GPGE 图谱中SOD 谱带清晰, 点样量适中时为扁平形, 边缘明显, 有较高的分辨率, 牛血SOD可清晰辨认出4条带, 番茄和朱桔粗酶液可分辨出4~ 5条带, 在PAGE图谱中因干扰的存在大大影响了谱带的分辨, 它们的谱带较模糊只有2~ 3条. 纯化的枸杞Fe-SOD在GPGE 和PAGE 中都有3条带, 但前者的灵敏度和分辨率明显高于后者. 高的灵敏度和分辨率使实验结果更准确可靠, 可见, GPGE 分离SOD特别是Fe-SOD 是比PAGE 更好的方法.

3.3 GPGE 分离和鉴定SOD的可靠性

本文发现在C区对SDS敏感的谱带(金荞麦和还亮草)也能被KCN 和H2O2 抑制为CuZn-SOD, 说明了以Rf 值来判断SOD类型是可靠的. 植物材料中的次生物质丰富, 它们会与SOD结合影响酶显示 , 朱桔Fe-SOD(新叶)和何首乌Mn-SOD (图片未列出)在PAGE 中几乎无带, 在GPGE 中含量都达30%左右,与二次电泳结果一致, 提示在GPGE 中经长时间电泳后干扰物可能与SOD 分离泳出凝胶, 能真实反映出全部SOD 谱带, 而PAGE会造成一些SOD的漏检. SOD谱带在GPGE 和PAGE 中对应关系由二次电泳反映出来, GPGE中的SOD 谱带通过二次电泳都能和PAGE 的相互对应, 说明了GPGE 分离和鉴定SOD的结果是可靠的, 但PAGE 中3种SOD 类型的Rf 值变化很大, 与酶类型间无相关性, 同时, 通过二次电泳还可以看出, GPGE 对在PAGE 上重叠和有干扰的SOD谱带的分离和鉴定是有效的.

GPGE 在分离和鉴定SOD方面有诸多优势, 但对研究带有不同电荷的同一类型SOD同工酶, 则PAGE会更好地反映出同工酶间的差异, 可见, 将GPGE 和PAGE 相结合研究植物SOD同工酶是更科学的方法.