在马铃薯的农业生产中，晚疫病是影响其生长发育的重要病害。它是由致病疫霉菌引起的，当温度和湿度达到一定条件后，在大田中会迅速传播，被侵染的植株会成片凋亡。SSR( simple sequence repeat) 标记是一种新型的、简单快速的分子标记方法，在研究群体遗传结构方面具有明显的优势。因此，应用该技术开展的相关科研工作也非常多，在真菌、卵菌、植物和动物上都有研究报道。其最突出的特点是结果稳定性好，具有高多态性和呈共显性，目前已经有很多适用于致病疫霉的SSR 标记被开发。

聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE) 技术一种被普遍适用的分子检测技术，其特点是检测灵敏度和分辨率都比较高，并且操作方法简单、试验时间短，对样品需求量少，在RAPD、AFLP、SSR 等分子标记中经常会用到。笔者以2009 年在宁夏固原及周边地区采集分离得到的73 个致病疫霉菌为材料进行SSR 分析，总结了试验中PAGE 凝胶电泳和银染技术的一些经验，建立了一种快速、简便的适用于致病疫霉菌SSR 标记的电泳和染色技术方法。

1 材料与方法

1． 1 供试材料于2009 年9 月，在宁夏固原地区采集马铃薯晚疫病菌菌株样品，实验室分离纯化得到73 个致病疫霉菌分离物。SSR 引物由金斯瑞公司合成。主要生化试剂，如Marker、酶、dNTPs、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺等均购自大连生物工程公司。

1． 2 DNA 提取基因组DNA 的提取采用西北农林科技大学生命科学学院实验室改良的玻璃珠振荡粗提法，具体方法参照李海娟等人的方法。DNA 的保存用TE( Tris-EDTA)缓冲液，置于-20 ℃的冰箱内保存。

1． 3 PCR 扩增用8 对在基因组中互不连锁的SSR 引物PI02、PI4B、PI63、SSR4、SSR8、SSR11、G11、D13 对基因组DNA进行PCR 扩增。PCR 基本反应程序: 94 ℃变性2 min; 94 ℃变性30 s， 66 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，共13 个循环，每个循环退火温度降低1 ℃; 94 ℃变性30 s 秒， 53 ℃退火30 s， 72℃延伸30 s，共28 个循环; 72 ℃延伸2 min; 10 ℃保存。引物D13 的退火温度为60 ℃，引物G11 的退火温度为64 ℃，其他条件一致。

1． 4 PAGE 试验采用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增的SSR 片段。不同大小的片段经过多次试验，使用8%和12% 2 种不同浓度的凝胶进行电泳分离。聚丙烯胺凝胶的配制方法如表1 所示。

电泳操作步骤: ①组装制胶器; ②用移液枪将配制好的醛溶液300 μl 加入到300 ml 1. 5%氢氧化钠溶液中待用。

1． 5． 2 染色步骤。染色( 摇床，0.1%硝酸银溶液，一般不超过20 min) →蒸馏水洗2 次→显色( 摇床，加入甲醛的1. 5%氢氧化钠溶液，至条带清晰即可) →终止→蒸馏水洗2 次→照相。

2 结果与分析

2． 1 PCR 扩增结果用8 对在基因组中互不连锁的SSR引物对基因组DNA 进行PCR 扩增，引物目的片段大小如表2所示。

试验结果表明，采用12% 聚丙烯凝胶电泳检测引物D13、G11，8%聚丙烯凝胶电泳检测引物PI4B、PI63、SSR4。用这2 种浓度的凝胶进行检测取得了比较理想的电泳及染色效果。

由此可见，此种方法检测马铃薯晚疫病原菌SSR 标记，取得了良好的效果。这样大大缩短了试验时间，并且简化了试验步骤，检测灵敏度高、操作简单、获得的条带清晰等特点，这是一种行之有效、简便快捷的检测方法。

3 讨论

PCR扩增产物的片段检测可采用琼脂糖电泳法，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法。琼脂糖电泳的分辨率较低，不能满足该试验中所用的8 个引物扩增片段检测的要求。

使用PAGE 进行检测时，通常需要根据分离的DNA 片段大小配制不同浓度的凝胶，一般在3． 5% ～ 20． 0%。而该试验摸索出的针对致病疫霉菌的聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件以及银染方法操作过程简单，试验时间大大缩短，可为开展致病疫霉菌的群体遗传方面的研究提供便利。

染色方法实验室通常使用EB 染色或银染。用EB 染色，灵敏度低，染色效果不好，得到的条带模糊、暗淡。而EB 本身有毒，并对环境会造成污染。该试验采取了银染的方法，笔者将染色的操作方法作了改进。改进后的方法缩短了银染的时间，操作程序简单、灵敏度高、染色液容易保存，大大简化了实验步骤。

另外，凝胶的浓度和电泳时间是影响试验结果的重要的参数。试验结果表明，在聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8%、电泳电压为200 V 的情况下，电泳1. 5 h，在聚丙烯酰胺凝胶的浓度为12%、电泳电压为200 V 的情况下，电泳2 h，PCR产物多态性条带清晰、明亮、稳定，为分析数据提供有利证据。