［摘　要］为探索猴腿蹄盖蕨多糖脱蛋白的最佳工艺条件，以蛋白去除率为主要考察指标，采用Ｓｅｖａｇ 法、ＴＣＡ法、酶法等５种方法对猴腿蹄盖蕨多糖脱蛋白工艺进行了探索。结果表明：最佳脱蛋白工艺为酶法与ＴＣＡ法联用，即加入０．０２ｇ木瓜蛋白酶，４０℃水浴反应３０ｍｉｎ后，沸水中灭酶１０ｍｉｎ，冷却至室温，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心，去变性酶沉淀，取上清液加入３％ＴＣＡ 试剂振荡３次，每次２０ｍｉｎ，震荡后静置１ｈ，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。在该条件下，猴腿蹄盖蕨多糖的蛋白去除率为７６．５０％，多糖损失率为１１．８２％。通过试验研究得到的猴腿蹄盖蕨多糖脱蛋白工艺条件稳定、重现性高，具有一定的应用价值。

［关键词］猴腿蹄盖蕨；多糖；脱蛋白工艺

　蕨类植物是植物类中草药的重要组成部分［１］，多数蕨类植物既可食用，又可入药。蹄盖蕨科植物猴腿蹄盖蕨，又名多齿蹄盖蕨、猴腿菜、猴腿儿，既是味道鲜美的山野菜，又可作为药品添加剂使用［２］。猴腿蹄盖蕨在吉林省长白山区分布广泛［３］，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等众多功效［４］，猴腿蹄盖蕨含有丰富的氨基酸，总含量可达１３．４６％，其中被誉为“智慧酸”的谷氨酸，含量可达２．２２％。作为药

食两用珍贵的山野菜，猴腿蹄盖蕨发展前景非常广阔［５－６］。多糖是由单糖或衍生物聚合而成的生物活性大分子，是一切生命有机体必不可少的成分。多糖具有增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗疲劳及抗衰老等多种生物活性，已应用到保健品、化妆品、药品、食品等领域，是现代医学和食品功能化学关注的焦点［６－９］。但是，在植物多糖研究过程中，植物中所含蛋白常影响植物多糖纯度，从而导致其药理研究出现较大差异。蛋白质是粗多糖中最主要的杂质，对植物多糖的纯度造成影响。蛋白质的存在增加了多糖的吸湿性，其所带电荷可吸附大量其他杂质，使杂质的去除变得更为困难。同时，蛋白质还会吸附多糖，给多糖的分级、分离带来困难。更重要的是，蛋白质具有热源性，含有蛋白杂质的多糖不能用于临床注射。因此，多糖纯化的第一步就是脱蛋白。而一般去除蛋白质的过程中多糖的损失量较大，所以有必要对多糖的脱蛋白方法进行研究。目前，未见猴腿蹄盖蕨多糖相关研究的报道。笔者应用传统的脱蛋白方法Ｓｅｖａｇ法、ＴＣＡ法、酶法等［１０－１４］对猴腿蹄盖蕨多糖脱蛋白的工艺进行探索，以期为更有效地开发猴腿蹄盖蕨提供理论依据。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 猴腿蹄盖蕨采自吉林市蛟河地区，经吉林化工学院药学系薛健飞博士鉴定为蹄盖蕨科植物猴腿蹄盖蕨。

１．１．２ 试剂木瓜蛋白酶（酶活性为５０万Ｕ／ｇ），北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、正丁醇、氯仿、三氯乙酸、硫酸、苯酚、无水乙醇均为分析纯试剂；水为重蒸馏水。

１．１．３ 仪器ＵＶ－７５２Ｎ型紫外－可见分光光度计，（上海精密科学仪器有限公司），ＲＴ－０８型多功能粉碎机（荣聪精密科技有限公司），ＢＳ－６００Ｌ型电子天平（上海精密科学仪器有限公司），ＲＥ－５２Ａ 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

１．２ 方法

１．２．１ 多糖含量测定

１）标准曲线的绘制。精密称取在１０５℃干燥至恒重的葡萄糖标准品２０．４ｍｇ，置于１００ｍＬ的容量瓶中［１５］，加入蒸馏水适量，超声使溶解，蒸馏水定容至刻度，制成浓度为０．２０４ｍｇ／ｍＬ的葡萄糖标准品溶液。取上述溶液２．０ ｍＬ、４．０ ｍＬ、６．０ ｍＬ、８．０ｍＬ、１０．０ｍＬ、１２．０ｍＬ、１４．０ｍＬ，分别置于５０ｍＬ容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度。精密吸取上述溶液各２．０ｍＬ于具塞试管中，加入４％苯酚溶液１．０ｍＬ，摇匀，迅速滴加７．０ｍＬ的浓硫酸，放置５ｍｉｎ，置于４０℃的水浴中加热３０ｍｉｎ，迅速冷却至室温，采用紫外－可见分光光度计，在４９０ｎｍ波长处测定吸光度，以浓度Ｃ为横坐标，吸光度值Ａ 为纵坐标，绘制标准曲线［１６］回归方程：Ａ＝１１．８６５Ｃ＋０．００１　８６，ｒ＝０．９９９　５，结果表明，葡萄糖在０．００８　１６～０．０５７　２ｍｇ／ｍＬ与吸光度呈良好的线性关系。

２）样品多糖的含量测定。取猴腿蹄盖蕨多糖粉末适量，置于容量瓶中，加蒸馏水适量，超声使溶解，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液。吸取供试品溶液２．０ｍＬ于具塞试管中，加入４％苯酚溶液１．０ｍＬ，摇匀，迅速滴加７．０ｍＬ的浓硫酸，放置５ｍｉｎ，置于４０℃的水浴中加热３０ｍｉｎ，迅速冷却至室温，采用紫外－可见分光光度计，在４９０ｎｍ波长处测定吸光度，由回归方程计算出多糖浓度，从而计算出粉末中多糖的质量以及多糖损失率。多糖质量（ｇ）＝（Ｃ×１０×２５×１００×干浸膏质量）／１０００×２×２×含量测定取样量；多糖损失率（％）＝（粗多糖中多糖质量－除蛋白处理后样品中多糖质量）／粗多糖中多糖质量；式中，Ｃ 表示测定样液中多糖的浓度（ｍｇ／ｍＬ）。

１．２．２ 蛋白质含量测定吸取多糖提取液１．０ｍＬ定容于２５ｍＬ容量瓶，以蒸馏水为空白，在２８０ｎｍ和２６０ｎｍ处测定吸光度值，根据经验公式：蛋白质浓度Ｃ（ｇ／Ｌ）＝１．４５×Ａ２８０－０．７４×Ａ２６０［１７－１８］，计算蛋白质含量，从而计算去除率。

蛋白去除率（％）＝（粗多糖中蛋白质量－除蛋白处理后样品中蛋白质量）／粗多糖中蛋白质量

１．３ 脱蛋白试验

１．３．１ Ｓｅｖａｇ法脱蛋白试验［１９－２０］

取猴腿蹄盖蕨粗多糖溶液２５ｍＬ，加入一定量的Ｓｅｖａｇ试剂（Ｖ正丁醇∶Ｖ氯仿，１／５），进行几次一定时间的剧烈震荡后，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心，取上清液即可。Ｓｅｖａｇ试剂加入量、震荡次数和震荡时间通过以下考察试验进行确定。

１）Ｓｅｖａｇｓ试剂加入量。Ｓｅｖａｇ试剂体积／多糖溶液体积分别为１／１、１／２、１／３、１／４、１／５，固定震荡时间为２０ｍｉｎ，震荡次数为１次，考察Ｓｅｖａｇｓ试剂加入量对多糖损失率和蛋白去除率的影响。

２）震荡次数。改变震荡次数（１次、２次、３次、４次、５次），固定Ｓｅｖａｇ试剂为５ｍＬ，震荡时间为２０ｍｉｎ，考察震荡次数对多糖损失率和蛋白去除率的影响。

３）震荡时间。改变震荡时间（１０ｍｉｎ，２０ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ），固定Ｓｅｖａｇ试剂为５ｍＬ，震荡次数为１次，考察震荡时间对多糖损失率和蛋白去除率的影响。

１．３．２ 三氯乙酸法（ＴＣＡ 法）脱蛋白试验取猴腿蹄盖蕨粗多糖溶液２５ｍＬ，分别加入ＴＣＡ 溶液使其质量分数分别为２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％，振荡２０ ｍｉｎ，静置１ｈ，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，弃去沉淀。考察溶液中不同ＴＣＡ 浓度的脱蛋白效果。确定最佳的ＴＣＡ 浓度后，在该条件下考察ＴＣＡ 法不同震荡次数（１次、２次、３次、４次、５次）下的脱蛋白效果，计算蛋白去除率和多糖损失率。

１．３．３ 酶法脱蛋白试验取猴腿蹄盖蕨粗多糖溶液２５ｍＬ，放入水浴锅中预热１０ｍｉｎ，加入一定量的木瓜蛋白酶，在一定温度下酶解反应一段时间后，４０℃水浴反应３０ｍｉｎ后，沸水中灭酶１０ｍｉｎ，冷却至室温，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心，去变性酶沉淀，取上清液

即可。木瓜蛋白酶加入量、酶解温度、酶解时间通过以下考察试验进行确定。

１）木瓜蛋白酶加入量。分别加入木瓜蛋白酶量０．０１ｇ、０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ，固定酶解温度为４０℃，酶解时间为０．５ｈ，考察木瓜蛋白酶加入量对多糖损失率和蛋白去除率的影响。

２）酶解温度。改变酶解温度（４０℃，４５℃，５０℃，５５℃，６０℃，６５℃）， 固定蛋白酶加入量０．０２ｇ，酶解时间为０．５ｈ，考察酶解温度对多糖损失率和蛋白去除率的影响。

３）酶解时间。改变酶解时间（０．５ｈ，１．０ｈ，１．５ｈ，２．０ｈ，２．５ｈ），固定蛋白酶加入量０．０２ｇ，酶解温度为４０℃，考察酶解时间对多糖损失率和蛋白去除率的影响。

１．３．４ 酶法与Ｓｅｖａｇ法联用脱蛋白试验取猴腿蹄盖蕨粗多糖溶液２５ ｍＬ，放入水浴锅中预热１０ｍｉｎ，在优选的木瓜蛋白酶法工艺条件下进行脱蛋白后，将反应瓶放入沸水中灭酶１０ｍｉｎ，冷却至室温，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心，去变性酶沉淀，取去蛋白后的猴腿蹄盖蕨多糖上清液２０ｍＬ，在优选的Ｓｅｖａｇ法条件下进行脱蛋白试验，测定其多糖及蛋白质含量，计算多糖损失率和蛋白去除率。

１．３．５ 酶法与ＴＣＡ 法联用脱蛋白试验取猴腿蹄盖蕨粗多糖溶液２５ ｍＬ，放入水浴锅中预热１０ｍｉｎ，在优选的木瓜蛋白酶法工艺条件下进行脱蛋白后，将反应瓶放入沸水中灭酶１０ｍｉｎ，冷却至室温，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心，去变性酶沉淀，取去蛋白后的上清液２０ｍＬ，在优选的ＴＣＡ法条件下进行脱蛋白试验，得脱蛋白多糖溶液，测定其多糖及蛋白质含量，计算多糖损失率和蛋白去除率。